呼吸道病原體多重快速檢驗套裝開發

呼吸道病原體多重快速檢驗套裝開發

呼吸道病原體常引起威脅生命的疾病，也是造成死亡的主要感染原因

之一。 呼吸道病原體，包含寄生蟲、真菌、細菌和病毒。 在兒童，呼吸道

融合病毒、鼻病毒、人類偏肺病毒(metapneumovirus) 、博卡病毒(bocavirus)、

副流感病毒(parainfluenza)是在已開發和發展中國家最常見引起肺炎的呼吸

道病原體。 在成年人，流感病毒與細菌仍持續在引起成人呼吸道感染。 分

子檢驗方法的進步，增加了我們對呼吸道病原體引起疾病所扮演的角色，

也說明這些感染性疾病的發生率可能被低估了。 本計畫之目的在開發一可

多重性、敏感且快速地檢測肺炎呼吸道病原體的檢驗套件。 實施方法為將

現有使用中單一或多重 real-time PCR 病原體檢測方法常用 24 種呼吸道

病原體，含 A 型流感、B 型流感病毒、腺病毒、呼吸道融合病毒、冠狀

病毒(229E, OC43, NL63, HKU1, MERS)、人類偏肺病毒(metapneumovirus)、

博卡病毒(bocavirus)、副流感病毒 1-4 型(parainfluenza type 1-4)、腸道病毒、

鼻病毒、人類單純皰疹病毒 1, 2 型、鉅細胞病毒(CMV)、VZV、parvovirus

B19、退伍軍人菌、肺炎黴漿菌，加上 12 種病原體 EBV, HHV6, HHV7,

HPeV, Chlamydophila pneumoniae, Pneumocystis jirovecii, Coxiella burnetii,

Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae 與被忽視 influenza C

virus, human orthoreovirus, Saffold virus 整合成完整的呼吸道檢測套裝。 36

種呼吸道病原體檢測靈敏度約 10-100 copies，且採單一條件反應條

件，易於靈活模組化，後續可接軌客製化自動化多重檢測平台，形成任務

導向的檢測套組。 此病原體檢測套組的開發，除了可節省呼吸道病原體的

檢驗時間與提高檢驗的穩定性與品質，降低取得檢驗試劑之傳染病防治成

本，亦顧及市售檢測忽略未涵蓋的病原體。

急性呼吸道感染仍是全球公共衛生一大負擔，肺炎也是兒童發病和死亡

的主要感染原因之一。 在一回顧性文獻的研究報告在 2010 年，5 歲以下孩

童約 1.2 億人次肺炎，其中 1 千 4 百萬人重症；在 2011 年約 130 萬人因肺

炎導致死亡[1]。 多種呼吸道病原體會導致肺炎，在兒童，呼吸道融合病毒

(RSV)，鼻病毒(Rhnovirus)，人類偏肺病毒(metapneumovirus), 博卡病毒

(bocavirus), 副流感病毒(parainfluenza)是在已開發和發展中國家最常見引

起肺炎的病原體。 雙重病毒感染是常見的，約 1/3 為病毒 - 細菌混合感

染。 在成年人中，病毒引起的社區肺炎約佔 1/3，特別是流感病毒，鼻病毒，

和冠狀病毒。 而細菌仍持續在引起成人肺炎有主導的地位[2]。

呼吸道感染在微生物檢驗上，有其重要性與必要性，微生物檢驗的結

果實將有助於藥物的使用，與疾病傳播的控制。 傳統上，利用基本的培養技

術藉由特殊的培養基以及特殊的培養環境來鑑定不同微生物的種類的鑑

定。 不過，這種方法遇到不易培養或被要求需要迅速的診斷決定的情況下

並不適用。 近年來，以 PCR 為基礎的方法來檢測呼吸道病原體已逐漸成為

市售套裝且對無法或難以培養的病原體有很高的檢出率並且可即時提供臨

床端相關的資訊。 一般 PCR 方法的靈敏度比傳統檢測方法高，對於新發現

的病原體也能快速的應對發展出檢驗方法。 近年來各種高通量檢測平台已

改變現代檢驗實驗室的運作方式，從微生物培養與抗原檢測等方法逐漸轉

移至以使用 PCR 為基礎的標準檢驗方法。 有些 PCR 檢驗方法兼具定性與定

量，且 PCR 放大的產物，可用來基因定序，分析病原體的遺傳資料。 [3-6]

近年來，多種會引起呼吸道感染的新興呼吸道病原體的出現，如 2003

年 SARS, 1997 年 H5N1, 2009 H1N1pdm09, 2013 H7N9 新型流感, 2012

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MERS-CoV，嚴重威脅公共衛生和人類的健康且造成社會大眾的恐慌，為

了及時檢驗與監測這些病原體，快速地建立病原體檢測方法有其必要。 世

界衛生組織或新興病原體的發現者皆會即時公佈 real-time RT-PCR 檢測方

法的引子與探針序列[7-11]，說明 real-time RT-PCR 檢測方法在新興病原體

檢測的重要性。 因 real-time PCR/RT-PCR 在建立檢測上的便利性與靈活性，

當病原體突變時，也可即時更新引子與探針序列，維持高靈敏性[12]。

  引起呼吸道感染的病原體種類繁多，傳統的病原體檢測技術 ，單次的

試驗裡只能檢測一個或數種已知的病原體。 當面對未知病原體所引的感

染，若單一病原體的檢測方法，已日漸不符合需求。 整合 multiple real-time

PCR/RT-PCR， 寡核苷酸微陣列病原體晶片(microarray)，高通量基因定序

(NGS)建立不明原因呼吸道疾病之檢驗流程，real-time PCR/RT-PCR 因其高

敏感性與特異性，設計方便，檢驗時間短，仍會是分子檢驗的主流與第一

線方法，但其缺點是同一反應最多檢驗 4 種病原體，若要檢驗 20 種病原體

需分作 5 個以上反應，檢驗操作繁瑣。 微陣列病原體晶片的優點是可同

時檢測上千種病原，缺點是靈敏度低，檢測極限約低 real-time PCR 50 倍 (各

為 100, 5000 copies/reaction)，檢測時間長(2-3 天)，檢驗成本高。 高通量基

因定序(NGS)的優點是可檢測未知新的病原體，檢測靈敏度高，缺點是檢測

時間長(1-2 天)，資料分析亦耗時、檢驗成本也高。 在各種檢驗平台不斷推

陳出新下，可依不同疾病微生物檢驗的需要，如項目多寡、檢驗的靈感度、

時效、成本等因素，有效整合流媒體各平台，達到最大的效益。 本計畫擬

發展一兼具快速、方便、敏感度高的呼吸道病原體檢測平台，可強化呼吸

道病原體之監測與檢驗。 將在已建立 24 種病原體 multiple real-time

PCR/RT-PCR 檢測方法，包含 A 型流感、B 型流感病毒、腺病毒、呼吸道

融合病毒、冠狀病毒(229E, OC43, NL63, HKU1, MERS)、人類偏肺病毒

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(metapneumovirus)、博卡病毒(bocavirus)、副流感病毒 1-4 型(parainfluenza

型態 1-4)、腸道病毒、鼻病毒、人類單純皰疹病毒 1, 2 型、鉅細胞病毒

(CMV)、VZV、parvovirus B19、退伍軍人菌、肺炎支原菌，擴充至 36 種，

增加檢測項目包含 EBV, HHV6, HHV7, HPeV, Chlamydophila pneumonia,

Pneumocystis jirovecii, Coxiella burnetii, Haemophilus influenzae,

Streptococcus pneumonia, influenza C virus, human orthoreovirus, Saffold

virus。 36 種呼吸道病原體檢測靈敏度 10-100 copies,且檢驗採單一條

件反應條件，可易於靈活模組化，後續可接軌客製化自動化多重檢測平

台，形成以任務為導向的檢測套件。 此病原體檢測套組的開發，除了可節省呼

吸道病原體的檢驗時間與提升檢驗的穩定性與品質，降低取得檢驗試劑之

傳染病防治成本，亦顧及市售檢測忽略未涵蓋的病原體。

(2)材料與方法

1. 36 種呼吸道病原體 real-time RT-PCR 檢測平台建立與優化：

(1)建立吸道病原體引子與探針對資料庫：已建立 24 種呼吸道病原體的

real-time PCR/RT-PCR 方法的引子和探針序列有些來有自文獻、經修飾

優化或自行設計，可偵測病原體包括 A 型流感、B 型流感病毒[12,13]、

腺病毒[14]、呼吸道融合病毒[15]、冠狀病毒(229E, OC43, NL63, HKU1,

MERS)[7,16,17] 、 人 類 偏 肺 病 毒 (metapneumovirus)[18] 、 博 卡 病 毒

(bocavirus)[16]、副流感病毒 1-4 型(parainfluenza type 1-4)[15,16]、腸道疾病

毒[15]、鼻病毒[19]、人類單純皰疹病毒第 1, 2 型[20]、鉅細胞病毒

(CMV)[20]、退伍軍人菌[21]、肺炎黴漿菌[21]等。 建立新增 12 呼吸道

病原體的 real-time RT-PCR 資料庫參考科學文獻，搜尋針對吸道病原體

檢測引子探針對的目標區域，並透過 NCBI 基因數據庫，下載各吸道病

原體基因序列，經比對後，根據吸道病原體的保守情況 (conservation)，評估各檢測目標區域的適用性。 time RT-PCR 專一性檢測用引子與探針。

(2) 使用 AlleleID (Premier Biosoft) 程序，設計病原體檢測之 real-time

PCR primers與probes，選擇此病原體之保守區設計為primers與probes

座落位置，利用 PCR 選殖製備陽性對照 plasmids，將純化陽性對照

plasmids 定量後，進行 10 倍稀釋，每個反應之陽性對照 plasmids 之

數目從 109~1 ，以 real-time PCR Ct35 為陽性檢測極限值。 各 real-time

PCR 反應皆使用相同條件，以利後續整合至單一反應之檢測套組。

(3)實驗流程包括樣品核酸萃取及逆轉錄與 real-time PCR 反應與結果分析。

實驗步驟如下：驗流程包括樣品核酸萃取及逆轉錄與 real-time PCR 反應

與結果分析。 實驗步驟如下：(1)逆轉錄反應 (Takara Cat. #6110A)：利用

自動核酸萃取系統 MagNA Pure Compact Instrument (Roche Applied

Science)進行樣品核酸萃取，取 5 μL 萃取核酸，利用隨機核苷酸

(random octamer)進行反轉錄反應，合成第一股 cDNA (first strand

cDNA)：核酸與引子於 65℃作用 5 分鐘後，置於冰上，再利用 PrimeScript

RTase reverse transcriptase 進行逆轉錄反應，反應條件為先 30℃作用 10

分鐘後，再次 50℃作用 60 分鐘，最後 95℃作用 5 分鐘。 (2) Real-time PCR

反應(LightCycler® 480 Probes Master)：20μL DNA 與 cDNA 產物與 1x

LightCycler 480 Probes Master、200nM forward primer、200nM reverse

primer 以及 100n M hydrolysis probe 混合。 混合物以 LightCycler 480 系

統(Roche Diagnostic)進行反應，反應條件如下：95℃ 10sec，續 45 cycles

之反應(95℃ 10 sec、50℃ 30 sec、72℃ 1 sec)，最後 30 sec 降溫(cooling)

至 40℃。

(4) 測試檢測套件的偵測靈敏度與特異性：利用陽性 DNA 質體，進行 10

倍續列稀釋，測試此檢測平台的偵測極限。

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(5) 使用肺炎監測與呼吸道群聚之陰性剩餘標本，回顧性新增檢驗 12 種

呼吸道病原體，理解增加 12 呼吸道

病原體檢驗方法後，提升多少檢

測陽性率，評估肺炎監測與呼吸道群聚的檢驗項目。